测定复方鱼腥草片中金丝桃苷的含量    【摘要】  目的 用RP-HPLC法测定复方鱼腥草片中金丝桃苷的含量。方法 HPLC用外标一点法, Kromasil C-18柱,乙腈-0.1%磷酸溶液(18:82)为流动相,柱温为30℃,流速为1.0ml/min,λ=360nm。结果 金丝桃苷在0.0675~1.35μg范围内呈良好线性,回归方程为Y=20.345X-12.118,R2=0.9999,平均加样回收率100.5%,RSD%为1.4%(n=9)。结论 方法简便、准确,专属性强,测定结果重复性好。为复方鱼腥草片中鱼腥草的定量分析提供了科学有效的方法。 
    【关键词】  复方鱼腥草片;金丝桃苷;HPLC
    【Abstract】  Objective  To establish the method for detemining the content of hyperosidein Fufang Yuxingcao Pion by RP-HPLC. Methods   Using Kromasil C18Column, acetonitrile-0.1% phosphoricacid solution(18:82)as the mobile phase,detection wavelength as 360nm and column temperature as 30℃. The flow rate was 1.0ml/min.Results  The calibrationcurve was linear at a range of 0.0675~1.35μgfor the hyperosideand linear equation was Y=20.345X-12.118R2=0.9999. The averagerecovery was 100.5% and the related standard deviation(RSD) was 1.4%(n=9). Conclusion  This method was simple and accurate and proper,which can be provide for scientific quantitative analysis method of hyeroside in Fufang Yuxingcao Pion,and the reduplicate of the result was good.
    【Key words】  fufang yuxingcao tablet; hyperoside;RP-HPLC
    复方鱼腥草片为《中国药典》收载品种,亦为民间常用药,具有清热解毒的功效,用于外感风热所致的急喉痹、急乳蛾,症见咽部红肿、咽痛;急性咽炎、急性扁桃体炎见上述症候者。本方由鱼腥草、黄芩、金银花、连翘等5味中药经提取加工制成。据现行药典及多数文献的报道,对复方鱼腥草片的质量控制多以黄芩苷作为指标进行研究。而在实际处方中,鱼腥草所占的量高达一半以上,为君药,故控制其中的鱼腥草的含量极其必要。现经实验论证,对方中的鱼腥草中所含的金丝桃苷的含量测定方法进行方法学研究,认为线性、重复性、回收率、精密度等均较理想。
    1  仪器与试药
    Agilent 1100系列高效液相色谱仪、G1322A(DEGASSER)溶剂脱气器、G1311A(QuatPump)四元泵、G1313(ALS)自动进样器、 G1316A(COLOM)柱温箱、G1315B(DAD)检测器及Agilent工作站;UV-可见紫外分光光度计(SHIMADZU);乙腈为色
    谱纯,其余均为分析纯;对照品金丝桃苷Hyperoside(批号1521-200202)购于中国药品生物制品检定所;样品复方鱼腥草片由海正药业提供(批号为050301,050302,050303)。
    2  测定方法的研究
    2.1  测定波长的确定  取金丝桃苷的甲醇溶液做光谱图测定,在360nm处有最大吸收,故检测波长选定360nm。
    2.2  流动相的选择  根据文献报道及《中国药典》的采用的流动相,比较了(1)乙腈-甲醇-四氢呋喃(1:1:19.4:78.6);(2)乙腈-0.1%磷酸(16:84),并设定柱温为30℃。根据上述二种流动相的实验结果,认为流动相(2)较理想。经调整,将"色谱条件与系统适用性试验"确定为用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-0.1%磷酸(W/V)(18:82)为流动相;流速为1.0ml/min;检测波长:360nm;柱温30℃。理论板数按金丝桃苷峰计算应不低于4000。色谱图1、2、3。图1  金丝桃苷对照品色谱图2  复方鱼腥草片样品图图3  缺鱼腥草阴性样品图
    2.3  提取方法选择  经查阅相关资料,对提取方法、提取溶剂、溶剂用量、提取时间进行考察,采用正交表L9(34)进行实验。见表1,2。表1  复方鱼腥草片含量测定法正交试验的因素表2  复方鱼腥草片含量测定法正交试验的计算从对金丝桃苷进行正交试验的简单计算来看,其中提取方法的影响相对较为明显,它的极差最大,其余各项的极差小,说明这些因素对金丝桃苷几乎没有什么影响。结合经济和环保等因素以及相对比较考虑,认为最佳的提取方案为采用60%的乙醇,加入样品50倍量的溶剂,回流提取40min。按此条件,又对同一批样品进行复核试验,根据复核试验的结果,金丝桃苷的平均含量为0.3512mg/g,与正交试验中的最大值0.3440mg/g相比较提高2.1%,由此证明所选最佳方案比较合理的。
    2.4  标准曲线、定量限、检测限  将对照品金丝桃苷配制成不同浓度的溶液,如表3。表3  线性关系考察
    2.5  对照品溶液及供试品溶液的制备
    2.5.1  对照品溶液的配制  取经真空干燥24h的金丝桃苷对照品12.5mg,精密称定,置50ml量瓶中,加甲醇使溶解,并稀释至刻度,摇匀备用。精密吸取上述对照品溶液1ml,置10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,制成每1ml含金丝桃苷25μg的溶液,作为对照品溶液。
    2.5.2  供试品溶液的制备  取本品20片,除去包衣,精密称定,研细,取1.0g,置圆底烧瓶中,精密加入60%乙醇50ml,称定重量,加热回流提取40min,放冷,再称定重量,用60%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液25ml,蒸干,残渣加60%乙醇溶解并定容到5ml量瓶中,摇匀,以微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液作为供试品溶液。
    2.5.3  测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
    2.6  重复性试验  取批号为050301的本品,按上述供试品溶液的制备方法,制备6份样品,按法测定,结果见表4。表4  重复性试验结果
    2.7  回收率试验  精密称取本品(批号:050301)测定量的半量按高、中、低取样品各3份,分别加入浓度为0.1510mg/ml的金丝桃苷对照品溶液1.2、1.0、0.8ml,按上述供试品溶液的制备方法,按法测定。见表5。表5  回收率试验结果
    2.8  精密度和稳定性实验  取批号为050301的样品1.0g,精密称定,按制备方法制成供试品溶液,同法测定6次,金丝桃苷的RSD为0.3%。见表6。 表6  精密度试验取同一样品分别在0、1、2、4、12、24h测定,金丝桃苷的RSD为0.4%,说明该成分在制剂中提取后较为稳定。见表7。表7  稳定性试验
    2.9  样品测定  取批号为050301、050302、050303的三批复方鱼腥草片样品,分别进行测定,结果见表8。表8  样品测定表由上述结果可知,此含量测定方法可运用于复方鱼腥草片中金丝桃苷的含量测定。
    3  讨论
    本品样品的制备条件,经按正交设计多因素提取比较,也进行了方差分析,结果几乎不呈显着性,说明金丝桃苷在所设的因素中互相影响较小,也说明它在甲醇和乙醇中溶解性都比较好。为此做了简单的计算得出了比较合理的样品溶液的制备方法。
    对鱼腥草药材的含量也做了测定,鱼腥草药材含金丝桃苷为0.32mg/g,按制剂中每片含有鱼腥草的量来计算,计算金丝桃苷的转移率为80%以上。由于本品中含的鱼腥草大部分为生药粉,所以制剂中的转移率相对比较高,也使得本品在临床治疗感冒的效果比较好。

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