细胞凋亡与肝脏疾病_在线论文查询
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刘增权 李孝生 400010重庆医科大学附属第二医院消化内科 自从1972年病理学家Kerr首先对细胞凋亡进行描述以来，经过20余年的研究，人们认识到细胞凋亡在组织的自动平衡中起着重要作用。细胞凋亡是通过正常的方式在多细胞生物中消除不需要的、衰老的和受损的细胞，使机体细胞有丝分裂的速度与凋亡的速度相平衡。任何情况的异常凋亡对机体都是有害的，都会产生不良后果，肝脏也不例外。目前人们认识到异常凋亡在肝病的发生、发展起着重要作用:一方面，肝细胞过度凋亡可以导致严重的肝脏损伤;另一方面，诱导凋亡机制的丧失可以导致肝癌的发生。因此，对肝病患者需抑制肝细胞的凋亡，对肝癌患者需选择性的诱导肝细胞的凋亡。 1 细胞凋亡的定义和检测方法 1.1 定义 细胞凋亡是一个主动过程，是机体在生理或病理条件下受到刺激后，导致细胞产生一系列形态和生化方面的改变而引起的程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）。细胞凋亡的特点:（1）细胞变小，核固缩，细胞膜完整。（2）核碎裂，DNA断裂成180～200bp，而且有蛋白质和mRNA的合成。（3）膜包绕的凋亡小体形成（在肝细胞称为Councilman小体）。（4）凋亡小体被邻近巨噬细胞吞噬，这整个过程进展非常快，由数分钟到几个小时 ［1］ 。（5）一般周围无炎症反应，但如果凋亡速度大于清除速度，则组织结构被破坏而且伴随炎症反应 ［2］ 。与凋亡不同，坏死是一个被动过程，坏死细胞变大，核溶解，膜通透性改变，线粒体结构变化，DNA随机断裂，其间没有蛋白质和mRNA的合成，坏死周围有炎症反应。 1.2 检查方法 （1）对细胞凋亡形态学的观察有HE染色光镜观察以及电子显微镜、相差显微镜、共聚焦激光扫描显微镜检查。（2）对DNA降解片段的分析有琼脂糖凝胶电泳检测DNA以及Southern Blotting方法。（3）荧光标记膜蛋白V的检测 ［3］ 。（4）流式细胞技术（FCM）可以对活体或已固定的凋亡细胞进行定量分析。（5）末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记术（TUNEL）。（6）免疫组化。 2 凋亡机制 细胞凋亡的生化特点包括质膜磷脂排列方向改变、细胞内离子环境自稳改变、蛋白酶和核酸内切酶激活分别致细胞蛋白质裂解和DNA断裂、细胞内产生神经酰胺（ceˉramide）、线粒体功能障碍、谷胱甘肽耗竭以及转谷氨酰胺酶（transglutaminase）激活 ［1，4］ 。 参与引发细胞凋亡的蛋白酶有多种，包括半胱氨酰天门冬氨酸特异蛋白酶（CASPSE，cysteingylaspartase specific proˉtease）家族成员和组织蛋白酶等 ［5］ 。特别是caspase家族成员与细胞凋亡关系最为密切，至少有14种哺乳动物caspase已获克隆，但仅对caspase-3和caspase-8的功能有所了解。caspase-8在细胞凋亡中发挥启动作用;caspase-3在细胞凋亡中发挥效应作用 ［6］ 。由于各caspase可相互激活，所以caspase蛋白酶级联反应（caspase protease cascade）是导致细胞凋亡结构改变的主要环节。线粒体功能障碍在细胞凋亡发生机制中起关键作用 ［6］ ，能促进线粒体功能障碍的因素很多，包括各种有害刺激和信号传递过程，其中某些配体/受体相互作用最为重要。配体与靶细胞表面受体相结合，就导致复杂的多蛋白复合物（multiprotein complex）形成，即将凋亡信号传递给效应蛋白酶FLICE（Fas-associated proˉtein like interleukin-1βconverting enzyme，Fas相关性蛋白样白细胞介素1β转化酶），FLICE与caspase-8相互反应可激活caspase-8，caspase-8激活后就通过某些不明的机制引发线粒体功能障碍。线粒体功能障碍导致细胞色素C释放，细胞色素C与凋亡激活因子-2（apoptosis activating factor-2，Apaf-2）相结合，使caspase-3激活 ［7］ 。caspase-3又激活DNA断裂因子（DNA fragmentation factor），导致静息状态的核酸内切酶激活，最终引起DNA断裂。从线粒体功能障碍到DNA断裂，是细胞凋亡生化途径的共同途径。 在肝细胞凋亡发生机制中，以Fas配体/Fas受体引发凋亡信号级联反应研究得最多。此外，转化生长因子β1（TGF-β1）及其受体（TGF-β1R） ［8］ 、肿瘤坏死因子（TNF）及其受体（TNFR） ［9］ 在肝细胞凋亡发生机制中均起重要作用。细胞毒性T细胞（CTL）释放的穿孔素（perforin）和颗粒酶B也是介导肝细胞凋亡的重要因素。 DNA断裂分两型。首先发生的DNA断裂片段较大，为300kbp或500kbp的倍数，此型DNA断裂在细胞凋亡中发生频繁，但并非都有。继之DNA在核小体（nucleosome）间断裂成许多100～200bp的小片断，或呈100～200bp的倍数出现，称为DNA断裂梯状模式（ladderpattern） ［10］ 。两型DNA断裂是由不同的核酸内切酶切割而形成的。也有人认为这两型DNA断裂可能单纯代表一种动力学现象，即必须先有足够大的DNA片段形成，方可发生小分子DNA断裂，用凝胶电泳技术、原位细胞化学技术或原位组织化学技术检测DNA断裂，是确定细胞凋亡的常用方法。 细胞凋亡的主要调节因子是B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B-cell lymphoma/leukemia-2protein，Bcl-2）家族的成员 ［11，12］ 。Bcl-2，通过抑制凋亡以延长细胞存活时间，是哺乳类动物细胞凋亡的一种强大抑制因子。与Bcl-2关系密切的同源物是Bcl-x，有两个RNA拼接变种，长Bcl-X（Bcl-XL）是较大的拼接变种，短Bcl-X（Bcl-XS）是短拼接变种。此外还发现一些其它的Bcl-2同源物。Bcl-2蛋白家族细胞凋亡抑制因子有:Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Bcl-XS、Mcl-1、Bfl-1、Brag-1、Al;细胞凋亡促进因子有:Bax、Bak、Bag、Bid、Bad、Hrk、Bik。 细胞凋亡促进因子和细胞凋亡抑制因子的相对优势决定着细胞对致凋亡刺激的反应性。Bcl-2及其同源物主要定位于细胞膜，包括内质网膜、核外膜和线粒体外膜。当细胞接受凋亡刺激时，Bcl-2可能通过防止线粒体功能障碍或阻断线粒体细胞色素C、Apaf-2释放而抑制细胞凋亡。Bcl-XL似乎在不表达Bcl-2的肝细胞承担这一功能。Bcl-2家族成员的表达在肝脏病和胆管细胞癌的发生中可能起重要作用，并参与调控肝再生反应。 3 肝脏疾病中的凋亡现象 近年来研究表明肝细胞的死亡方式包括坏死和凋亡两种。凋亡在肝脏疾病发展过程中的重要作用得到了人们的重视，现将有代表性的几种肝脏疾病中的凋亡现象分述如下。 3.1 病毒性肝炎 Fas系统介导的细胞凋亡在肝炎发生 发展过程中起着重要作用，在不同条件下，穿孔素、颗粒酶、TNF-α、TGF-β等也参与了肝细胞的凋亡 ［13，14］ 。1998年Galle等 ［15］ 报道乙型肝炎时肝细胞Fas表达增强，致敏的细胞毒性T细胞（CTL）表达Fas配基（FasL），CTL经过免疫途径介导肝细胞凋亡，参与病毒的清理和肝炎的病理生理过程。若该反应过强，则可能诱发暴发性肝功能衰竭。这已经得到大家的公认。 3.2 肝纤维化 肝纤维化是慢性肝病共有的病理改变，有研究表明各种类型的肝纤维化中都存在凋亡。肝星状细胞（HSC）的激活是肝纤维化发生的中心环节。1998年Gong等报道HSC向肌成纤维细胞（MFB）的转变与sFasL介导的凋亡增强相平行，Bcl-2和Bcl-XL在早期HSC上的表达高于晚期HSC和MFB，Bax则相反。这说明调节HSC的凋亡易感性在肝纤维化发生机制中起重要作用。故认为促进HSC的凋亡有可能成为抗纤维化的措施之一。 3.3 肝硬变 凋亡现象在肝硬变病例的肝细胞、胆管细胞、单核细胞中普遍存在。1999年Frommel等 ［16］ 对照研究了正常肝组织、丙型肝炎和肝硬变标本，发现对Bcl-2的表达逐渐增强，肝硬变患者中表达最强，提出了一种解释肝硬变患者中肝癌高发生率的新机制。 3.4 肝癌 肝细胞癌形成过程中，不仅癌细胞异常增生，而且突变的细胞凋亡减少，肝癌细胞对凋亡诱导反应明显缺陷 ［17］ ，1998年Jodo等报道肝癌血清中sFas水平升高，切除肿瘤后，sFas水平即下降。一些抑癌剂如:硒、类维生素A、化疗药物等可促进鼠肝的潜在恶性细胞的凋亡，从而降低肝癌的发病率，这从一个侧面反映了凋亡在肝癌发病机制中的地位。1997年Cras L等报道在非基因毒性致癌物nafenopin所致的原发性肝癌中，正常肝细胞和肝肿瘤细胞都会受到抑制。当nafenopin的作用消失后，二者的凋亡都增加。后者的增殖率和凋亡率都高于前者。因此，采取促进肝癌细胞凋亡的措施，将有可能成为未来治疗肝癌的有效手段之一。 3.5 酒精性肝病 凋亡可发生在临床和实验性的酒精性肝病中，酒精诱导肝细胞出现凋亡的机制有:（1）表达细胞色素P 450 2E 1 的HepG 2 细胞暴露于花生四烯酸导致了脂质过氧化和凋亡增加;（2）肝铁水平的升高也促进了脂质过氧化和肝细胞凋亡发生;（3）酒精性肝病中TNF及其受体的水平都升高，二者结合导致凋亡增加;（4）肝细胞CD95L的水平升高与肝组织中的CD95结合诱导凋亡;（5）CTL细胞也通过CD95与CD95L的结合促进凋亡的发生。 3.6 自身免疫性肝病 细胞凋亡对于清除潜在的自身反应性淋巴细胞以及免疫应答后剩余的效应细胞或突变细胞 具有重要意义。若该机制发生障碍，则可能导致自身免疫性疾病的发生。自身免疫性肝病中具有代表性的是原发性胆汁性肝硬变（PBC），它是一种免疫介导的肝内小胆管进行性损害为特征的自身免疫病。1997年Harada等报道 ［18］ PBC受损胆管上皮细胞高表达CD95L，CD95/CD95L途径的凋亡导致了胆管上皮细胞的破坏。 总之，细胞凋亡在某些肝脏疾病的发生、发展、转归中可能起着重要的作用，其具体机制有待进一步研究证实。 参考文献 1 Fraser A，Evan G.A license to kill.Cell，1996，85:781.2 Feldmann G.Liver apoptosis.J Hepatol，1997，26:1. 3 Van EnglishM，Nieland LJ，Ramaejers FC，et al.Annexin V-affinity assay:A review on an apoptosis detection system based on phosˉphatidylserine exposure.Cytometry，1998，31:1. 4 Vaux DL，Strasser A.The molecular biology of apoptosis.Proc NatlAˉcad Sci USA，1996，93:224-239. 5 Pater T，Gores GJ，Kaufmann SH.The critical role of proteases during apoptosis.FASEB J，1996，10:587-597. 6 Liu X，Kin CN，Yang J，et al.Induction of apoptotic program in cell-free extracts:Requirement for Datp and 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