体外肝代谢系统的研究和应用

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    【摘要】肝药酶在药物代谢中具有十分重要的作用。对肝药酶的研究方法中,以动物肝脏或肝细胞为基础,构建体外肝代谢系统是体外代谢研究中最重要的环节之一。对体外肝代谢的研究,主要是利用肝微粒体、基因重组CYP450酶系、肝细胞培养、肝组织切片及离体肝灌流系统等方法。本文综述近年国内外所应用的不同体外肝代谢系统,并对各体外代谢研究方法进行比较,指出根据各系统的特性、不同的实验要求和目的,选择适当的研究方法的重要性。
    【关键词】细胞色素P450酶;肝微粒体;肝细胞培养;肝组织切片;离体肝灌流
    药物代谢(drug metabolism)一般是指药物的生物转化(drug biotransformation)。药物经生物转化后,可引起药物的药理活性或∕和毒理活性的改变。因此,研究药物的生物转化,明确其代谢过程,对新药开发、新剂型设计及制定合理的临床用药方案等方面都具有重要的指导意义。肝脏是药物生物转化的重要器官,含有参与药物代谢重要的酶系(细胞色素P450酶,cytochrome P450,CYP450),该酶系参与药物及各种内源性和外源性化合物在体内的代谢过程。CYP450酶系由三十多种同工酶(亚型)组成,主要有CYP1、CYP2、CYP3三大家族[1]。本文所介绍的各种体外代谢系统均含有一种或多种CYP450酶的同工酶,为研究药物体外代谢提供了研究的对象和基础。动物肝体外代谢研究可以较好地排除体内因素干扰,直接观察酶对底物代谢的选择性,为整体试验提供可靠的科学依据。以肝脏为基础的体外代谢系统主要包括肝微粒体、基因重组CYP450酶系、肝细胞、肝组织切片及离体肝灌流。
    1肝微粒体
    1.1肝微粒体的制备
    多数采用差速离心法[2],通过高速离心使微粒体与其他成分分离,操作简单,无需其他试剂辅助。但较耗时,设备要求高,使该法的普及和深入研究受到一定的限制。针对这些情况,可采用试剂辅助分离的方法[3],在离心前额外加入一定比例的PEG6000或CaCl2,促进微粒体沉降。此法对设备要求降低,并缩短了实验周期。肝微粒体的制备过程均应在4 ℃下进行。正确、合理地选择缓冲液,能起到良好介质的作用,按比例加入后进行肝组织的破碎和匀浆,才可有效分离肝微粒体和避免细胞器受损。
    1.2肝微粒体的主要应用
    1.2.1测定CYP450酶活性
    测定原理是在特定酶催化下,底物在辅助因子以及适合的温度、时间作用下反应,借助仪器测定生成的特定产物量。由于反应可控和周期短,目前大多数P450酶以肝微粒体作为反应体系进行酶活性的测定[2]。各种酶活性测定的步骤基本相同,差别主要在于酶对应的底物和检测仪器的选择。一般以底物及代谢途经来命名各种酶,如7乙氧基试卤灵O脱乙基酶(CYP 1A1)[4]、氯唑沙宗羟化酶(CYP 2E1)[5]等。根据底物特性选择检测仪器,常用的有紫外∕荧光分光光度计,或联用HPLC系统。
    1.2.2考察药物对肝药酶活性的影响
    某些药物在体内不同程度地诱导或抑制肝药酶活性,这将影响到同时服用的其他药物的代谢,如抑制CYP 3A活性的药物(如红霉素等),若与其他经这一家族酶代谢的药物(如西尼地平等)同时服用,则可能减慢其代谢,从而增强药效或毒副作用[6]。近年来,关于考察中药成分对肝药酶活性影响的报道增多,从体外分子水平来评价它们对肝代谢的影响,可为中药配伍提供依据。如代方国等[7]考察给以甘草、甘遂、甘遂甘草配伍药液的大鼠的肝微粒体中CYP 2E1的活性,发现甘草组和配伍组对CYP 2E1活性的诱导作用显着高于甘遂组;甘遂可能通过诱导肝脏CYP2E1的表达与活性上升;甘遂甘草配伍使用时,甘草对CYP2E1活性的诱导能力更强,故两者配伍时,可促进甘遂所含前致癌物质和前毒物转化成为致癌物和毒物的过程,并导致对机体毒性作用的增强。
    1.2.3进行药物体外代谢途径研究
    将药物加入肝微粒体中进行孵育后,利用质谱检测离子碎片来鉴定代谢物的结构,包括药物不同位点上的羟化物或去烷基产物,从而确定代谢途径。有报道指出[8],新型抗焦虑药AF5加入人肝微粒体中进行孵育,经GCMS分析,鉴定出两种主要代谢产物:4羟基AF5(Ⅰ)及4羰基AF5(Ⅱ)。AF5在肝微粒体中代谢的主要产物为Ⅰ,Ⅰ在人肝微粒体中,可进一步转化为Ⅱ,后者不再被代谢。
    1.2.4考察手性药物的代谢立体选择性
    周权等[9]把手性药物与大鼠肝微粒体相结合,对其立体选择性代谢作了详细的考察。作者把R/S普罗帕酮(propafenone,PPF)加入经地塞米松或β萘黄酮诱导的大鼠肝微粒体中孵育,经提取及手性拆分后,进入HPLC系统分析。结果显示,与对照组相比,在经诱导的肝微粒体中,PPF的Ⅰ相代谢呈显着的立体选择性。
    总之,改进后的体外肝微粒体法耗时少,重现性好,易大量操作。适用于酶活性及体外代谢清除等方面的研究,在实际工作中应用较广。但同其他体外肝代谢方法相比,需要的原材料较多,且与体内情况的一致性方面存在不足,因而其结果是否有利预测体内情况仍需进一步研究。
    2基因重组人肝微粒体CYP450酶系
    利用基因工程及细胞工程,将调控CYP450酶系表达的基因整合到大肠杆菌或昆虫细胞,再经培养可表达高水平的CYP450酶系,纯化后还可获得较单一的CYP450同工酶。在明确某些药物经特定酶代谢后,即以此酶进行单一代谢,更准确地观察代谢结果,避免受其他酶共同参与此代谢途径的干扰。Ching等[10]通过在酵母中克隆方法,得到高表达的人CYP 1A1和CYP 1A2,用于测定普萘洛尔对映体的去烃基化和环羟化反应的立体选择性和酶动力学参数,明确了CYP 1A2均参与了2种途径,但CYP 1A1只参与了去烃化反应。有学者进一步运用重组人肝微粒体,应用酶抑制剂对普萘洛尔对映体的代谢途径进行对照实验[11-13]。其中Yoshimoto等[12] 应用基因重组的及人肝微粒体中的CYP酶系同工酶进行研究,发现α萘黄酮对普萘洛尔R/S对映体的N脱异丙基化(desisopropylation)抑制作用分别为20%和40%;奎尼丁对其2种对映体的4环羟化代谢的抑制作用较完全;而其他酶抑制剂对其对映体的影响较小。
    基因重组CYP450酶系与前述的肝微粒体在研究药物代谢方面具有一定的相关性。但前者在药酶诱导特异性和选择性研究上优于其他的体外方法,并可在分子水平上,为药物与酶在结合位点的相互作用研究提供更多的信息。尽管该方法先进性较为突出,但由于受到设备条件和技术的限制,通过基因工程获得的酶量与种类仍较有限,纯化程度有待进一步提高,故其作为研究代谢的体外系统的地位仍有待进一步提高。
    3肝细胞培养
    3.1体外培养技术与细胞活性的维持
    体外培养包括肝细胞株的培养和原代肝细胞的分离与培养。根据细胞来源于不同,经重复筛选可制备出不同型号的肝细胞株,满足各种实验需要。肝细胞株容易贴壁存活,在相对稳定的培养条件下,传20~30代不会出现明显衰老现象。原代细胞需经过从器官中分离的过程,存在分离难度大、体外培养要求条件高、存活时间短、增殖及传代困难等问题。多数研究者采用改良的Seglen两步胶原酶灌注法。但此法操作繁琐,设备及实验技术要求高,影响因素较多[14],包括灌注液的种类和速度、肝脏灌洗是否充分、分离消化的酶、培养液的组成和肝细胞悬液的离心清洗等。鉴于上述原因,刘友平[15]等采用肝组织块贴壁法原代培养,即只把组织块剪碎,不用胶原酶消化,直接按肝细胞的培养方法进行贴壁培养,在传代时加胰酶消化,只取上层细胞悬液继续培养。该法简单快捷,无需灌注、离心,所得肝细胞活力高。
    为了解决肝细胞活性体外维持时间短的问题, Hengstler[16]等研究优化肝细胞冷冻技术。同新鲜肝细胞相比,经过该技术冷冻储藏的肝细胞活性为新鲜肝细胞的80%以上,而其Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶的活性>60%,可用于反应时间不超过8h的代谢研究,亦可用于药酶的诱导研究,但该技术仍需进一步优化。
    3.2肝细胞培养的主要应用
    3.2.1进行药物体外代谢途径与体内相关性研究
    Nakagawa等[17] 将BPA[2,2bis(4hydroxyphenyl)propane,2,2双(4羟苯基)丙烷]加于大鼠肝细胞中,经质谱检测,BPA很快代谢为单葡萄糖醛酸结合物及2个次要代谢物(单硫酸结合物和3OHBPA)。在BPA体内代谢研究中发现,约20%~30%的BPA从尿中排泄,主要为首过效应中生成的葡萄糖醛酸结合物,其中硫酸结合物占尿液中总代谢物的2%~3%[18]。因此BPA肝细胞体外温孵与体内过程很相似,具有一定的代表性。
    3.2.2进行药物体外代谢清除研究
    Shibata[19]等人运用冷藏保存的人肝细胞混悬于100%的人血浆中,将预测的肝利用度及清除率与14种临床常用的药物的生物利用度和血浆清除率进行比较时,发现不同的细胞来源,内在清除率存在极大的个体差异性。同时在基础的生物定标系数(3.1×109 个/kg)下,用外推法将体外实验结果应用于体内实验的预测,往往会出现明显的偏低现象,因此计算的定标系数应比基础生物大3~5倍。为获得更可靠的定量预测结果,通过预试验来确定校正的定标系数是至关重要的环节。
    由于在新鲜分离的肝细胞中,介导药物代谢的CYP450酶系存在时间依赖性衰减的现象,所以一般的肝细胞培养都要求在肝细胞生存时间跨度内进行。Griffin和Houston [20]对体外单层肝细胞培养的内在清除能力(CLint)与新鲜游离肝细胞悬液的清除能力进行比较,发现其内在的清除能力与代谢速度有关,单层肝细胞体外实验更适合于代谢速度慢的药物。
    总之,用肝细胞培养方法作为评价药物代谢的体外系统,存在一定的偏差。其结果与体内的情况相近程度,很大程度上取决于研究者的经验。
    3.2.3参与新型多器官共培养

的研究
    在很长一段时间内,研究者都只是单纯考察药物代谢在某一种器官(如肝脏)中的作用情况。而实际上,药物在体内的过程是多因素综合作用的。根据最新报道[21], 肝细胞参与整体非连续性多器官共培养体系(IdMOC),即把肝细胞和来自于其他多个器官的非肝原代细胞一起培养,为在药物代谢和毒副效应方面评价多器官之间的相互作用提供可能性。
    肝细胞同肝微粒体相比,在代谢物生成、体外代谢清除等研究方面有许多相似性,但针对代谢物种类、主要代谢物及所反映的代谢特性上存在着质或量的差异。随着肝细胞冷冻技术的发展,因其体外活性维持时间短而造成的应用限制会不断得到改善。
    4肝组织切片
    在各种器官组织切片中以肝切片的应用最多,可在较长的孵育时间内保持代谢活性。据报道,小鼠肝切片可培育3~5 d[22]。组织切片的实验与培育条件使得其重现性比灌注器官的重现性容易得多。切片制备相对快捷而简便。但其缺点为切片机的大量使用受限,而且价格昂贵。De Kanter[23]等利用利多卡因、睾酮及7乙氧基香豆素为探针药物,进行了器官切片实验,结果表明,该系统具有多相代谢途径,且易于比较不同器官组织的代谢差别。研究发现不同种属及不同器官间代谢类型及速度不同。
    Vickers[24]用肝组织切片研究环孢素A(CSA)的代谢,CSA本身是CYP3A4的底物,但在人肝切片中加入1~10 mol/L CSA培育24 h,使CYP3A4活性降低了25%,说明在CSA高浓度时可减少本身的清除率而提高血药浓度。若用某些疾病的标记物加入肝组织切片中培育,也可研究药物的不良反应如对肝的损害(以GSP或核基质蛋白Numa为标记物)或对脂质代谢的影响(以Lp(a)为标记物)等。
    组织切片完整地保留了所有的肝药酶及细胞器的活性,而且保留了一定的细胞间质。这些特点相比于分子水平和细胞水平,更具宏观性与整体性,更能反映药物在体内生理情况下的实际代谢过程,为分子理论与离体器官之间,乃至临床应用架起了桥梁。
    5离体肝灌流
    5.1肝脏灌注的特点
    肝脏灌流技术作为一种与在体肝脏最具可比性的体外系统,有其突出的优点是可以在接近生理状况的条件下进行肝功能研究,保持完整细胞的天然屏障和营养液的供给,能排除其他组织、脏器的干扰及便于动态定量分析受试物及其代谢产物。因而离体器官灌注处于体内与体外的临界点。然而肝脏灌流技术亦存在缺陷,如受时间的限制、易受其他因素的干扰(如手术操作、灌流液组成、流速等),手术及插管操作技术极复杂。
    5.2离体肝灌流的主要应用
    5.2.1持续考察药物代谢
    利用离体肝的生理活性进行持续性的药物代谢考察及某些生命物质与药物之间的相互作用,以此有效预测体内-体外的相关性。Wang等[25]运用大鼠肝灌流,测定美托洛尔的Vmax和KM、代谢物的增加量和氨基酸的减少量,以此考察氨基酸对美托洛尔的抑制作用。结果显示:氨基酸可逆地减少了母药及代谢物的Vmax约50%,而对KM则影响不明显。氨基酸可能直接抑制了代谢美托洛尔的酶。因此估计多种类似代谢机制可有效影响人体内食物与高首过效应的药物。应用离体肝脏灌注,定性和定量检测灌流液中的母体药物及代谢产物浓度,可了解受试化学物质在肝脏内所发生的代谢变化及反应类型。
    5.2.2药物首过效应的研究
    首过效应明显的药物,生物利用度低,这在临床合理用药中受到重视。在药物研究过程中,应用分离肝细胞、肝匀浆、肝微粒体等体外方法虽可揭示药物肝脏代谢的机制和相关代谢酶系,但不能提供关于体内首过代谢程度的信息。Lau等[26]利用离体灌注大鼠肝模型,研究利福平对阿托伐他汀及其代谢物的生物转化的影响,认为口服阿托伐他汀生物利用度极低与首过效应有关,尤其是存在明显的肠道首过效应。
    5.2.3药物相互作用的研究
    Lucas[27]等应用一过式离体大鼠肝脏灌流模型研究了植物雌激素异黄酮对硫酸干扰乙酰氨基酚在肝脏形成及处置的影响,结果发现l0 μmol的异黄酮混合物能减少硫酸对乙酰氨基酚的形成,减少对乙酰氨基酚的肝清除。
    6结语
    肝体外代谢系统广泛应用于药物代谢研究的各个方面,在不同研究背景下互相补足。肝微粒体代谢快,易大量操作,近年来在大量文献中用于酶活性及体外代谢清除等方面的研究,在实际工作中应用较广。基因重组CYP450酶系在分子水平上的“单一性”为深入研究药酶诱导的“特异性”和“选择性”提供了技术支持。肝细胞所保持的完整微观结构,针对代谢特性及多种细胞共同作用等方面,均有较好的研究空间。而组织切片所保留的细胞器和细胞间质,以及离体肝灌注所保持的正常生理活性,可更全面地在“体外”这个层面上,为前3种微结构系统与体内一致性方面所存在的不足进行补充和完善。因此,根据各系统的特性,不同的要求和目的,分别选择应用,才能正确解释实验的结果,才能更好地接近临床实践。
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